冷鲜鹅系指将屠宰的鹅酮体体温在1 h内降温至0～4℃,并持续在0～4℃温度下加工、运输和销售的鲜鹅肉。[1]但其不足之处是微生物生长繁殖快而导致产品货架期短。 [2]气调包装(Modified Atmosphere Packaging,MAP)系指采用具有阻隔性强的材料制成的包装袋,通过充入一定比例的混合气体,防止食品在物理、化学、生物等方面出现品质下降或减缓品质下降的速度,使食品达到延长保质期目的的一种保鲜技术。但有关气调包装制品的保养技术尚未见报道。
本实验对气调包装冷鲜鹅进行4℃冷藏条件下微生物菌群数变化的序时测定,采用划线分离方法纯化代表性菌株,经染色、镜检、观察表型特征、生理生化试验、16 S rDNA测序加以鉴定。旨在为构建冷鲜鹅综合保鲜技术提供依据。
1 材料与方法1.1 材料冷鲜鹅:扬州市鹅司令食品有限公司;N2:北京氦普北分气体工业有限公司;25 cm×35 cm PA-PE复合光面透明包装袋:扬州市南方仪器设备化工有限公司。
1.2 培养基与试剂Pseudomonades培养基、MRS培养基、VRBGA培养基、STAA培养基、营养琼脂培养基均购自扬州市南方仪器设备化工有限公司。微量生化反应管:明发生物科技有限公司;TIANGEN试剂盒:上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.3 主要仪器设备FR980型凝胶成像仪:上海上天精密仪器有限公司;DZ-700/2S型真空包装机:郑州鼎盛包装机械有限公司;HC-2518R高速冷冻离心机:杭州华创科学仪器有限公司;XSP-13A型生物显微镜:江南光学仪器厂。
1.4 方法1.4.1 样品制备
冷鲜鹅→50 mg/L NaClO溶液浸泡、淋洗→无菌水冲洗、沥干→气调包装→4℃保藏。
气调包装条件:以无菌操作取25 g置于25 cm×35 cm PA-PE复合光面透明包装袋中,充入100% N2,充气时间15 s,加热时间5 s,加热温度60℃,总压力5 MPa。
1.4.2 气调包装冷鲜鹅保藏过程中菌群变化
以平板计数法测定菌落总数,统计菌相构成。
1.4.3 代表株分离与初步鉴定
代表株分离与纯化:从选择性平板上挑取典型菌落,经划线,分离纯化2～3次,将纯化的单菌落接种于斜面,于4℃冰箱保存,作为鉴定菌种。
表型特征观察:经涂片固定,染色,镜检观察其备检形态。对其菌落的隆起度、形状、颜色、透明度进行描述。
生理生化试验:依次进行糖发酵试验、醇发酵试验、接触酶试验、氧化酶试验、精氨酸脱羧酶试验以及O/F等试验。
1.4.5 代表株的PCR检测
采用TIANGEN试剂盒提取代表株DNA。参照周涛等[3]法进行PCR扩增，同时按高磊等[4]法进行16 S rDNA测序。
将所测序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中使用Basic Local Alignment Search Tool程序进行同源性比较,获得典型菌的DNA序列,运用MEGA7.0软件构建系统发育树。
2 结果与讨论2.1 气调包装冷鲜鹅冷藏过程中菌群的变化气调包装冷鲜鹅样品在4℃保藏过程中菌群的变化如图1所示。
图1 气调包装冷鲜鹅4℃保藏过程中细菌菌群构成的变化
由图1可见,在4℃保藏过程中,冷鲜鹅在保藏第1 d起,假单胞菌快速生长,最终成为第一优势菌。在4℃保藏条件下,肠杆菌虽然初始菌落总数较低,但1 d后一直呈增长趋势,最终成为第二大优势菌。索丝菌一直稳定生长,保藏末期占比也较高。乳酸菌也稳定增长,但不显优势。
经计算,菌相构成为假单胞菌占41.8%、肠杆菌占32.7%、索丝菌占23.1%、乳酸菌占2.4%。冷鲜鹅气调制品4℃冷藏至第4 d,肉色稍有绿变,有氨臭味,肉的表面出现发黏的现象。
2.2 细菌代表株的鉴定2.2.1 表型特征观察
从4类菌株中各选1株为代表株,编号分别为J1、C1、R1、S1,其特征形态见表1。
2.2.2 生理生化实验
代表株的生理生化结果见表2。
表1 气调包装冷鲜鹅中代表株的菌落特征及菌体形态
表2 气调包装冷鲜鹅中代表株的生理生化试验结果
注:“+”表示阳性,“-”表示阴性。
根据《常见细菌系统鉴定手册》[5]及《伯杰氏细菌鉴定手册》[6],通过显微镜观察的菌落形态特征、革兰氏染色阴阳性等特征,并结合表2,经初步鉴定:J1为Pseudomonas、C1为Enterobacteriaceae、R1为Lactobacillus、S1为Brochothrix。
2.2.3 构建系统发育树
用Basic Local Alignment Search Tool软件将4株菌种的所测序列与DNA序列数据库中已知序列进行比对分析,选取同源性较高的菌株序列构建系统发育树,结果见表3和图2。
表3 冷鲜鹅代表菌株测序的种属关系
图2 菌株系统发育树
由表3和图2可知：J1与莓实假单胞菌同源性最高;C1与液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)同源性最高;R1与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)同源性最高;S1与热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacat)同源性最高。
3 结论本实验通过研究气调包装冷鲜鹅在4℃冷藏条件下保藏4 d的菌群变化，可知优势菌数量关系为:假单胞菌>肠杆菌>索丝菌>乳酸菌。从相应选择性培养基中分离纯化出典型单个菌落,通过观察其菌落形态和生理生化试验及16 S rDNA鉴定结果,据此确定,气调包装冷鲜鹅由莓实假单胞菌、液化沙雷氏菌、植物乳杆菌、热杀索丝菌构成共生菌相。据此进行栅栏控制,可进一步提高冷鲜鹅的保鲜技术。
参考文献:
[1] 戴阳军,张卫东,沈燕君.响应曲面法优化冷鲜鸡的加工工艺[J].美食研究,2014,31(4):39-43.
[2] AMÉLIE R, NICOLAS M, HERVÉ P, et al. Diversity of bacterial communities in French chicken cuts stored under modified atmosphere packaging[J]. Food Microbiology,2018,70:7-16.
[3] 周涛,于娟,毛杨敏.真空包装盐水鹅中腐败细菌的分离鉴定[J].食品工业科技,2016,37(14):219-232.
[4] 高磊,谢晶,叶藻，等.冷鲜鸡腿肉中优势腐败菌的分离鉴定及腐败能力研究[J].食品与发酵工业,2015,41(8):48-53.
[5] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:364-370.
[6] 布坎南R E, 吉本斯N E.伯杰鉴定手册(第八版)[M].中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组,译.北京:科学出版社,1995:591-611.
